(conference title: V Italian CF Spring Seminar, Recent Advances and Future Developments in CF Research conference reference: CFF5 conference main topic: health conference date: 2007-05-11 conference location: Verona conference session: presentation session title: Pharmacotherapy of the CF basic defect speech event: paper or lecture speech number: 049b speech type: org-it speech title: Farmacoterapia del difetto di base nella fibrosi cistica duration: long timing: 2259 speech length: long number of words: 5454 speed: high words per minute: 145 speech delivery: mixed audio visual support: yes conference participant: presenter or lecturer
conference participant ID: Galietta, Luis gender: m country: Italy language: it native speaker: yes directionality: NA materials provided to interpreters: in advance audio link: DIRSI-2007-05-11-VR-CFF5-049b-org-it comments: NA)
e per l'identificazione di nuovi composti negli ultimi anni diciamo due
sono state pe- direi le entità principali che hanno attivamente cercato
nuovi composti chimici 0:12 //
uno la compagnia farmaceutica Vertex che è sponsorizzata dalla Cystic
Fibrosis Foudation americana e il professor Vertman all'università di
San Francisco con il quale noi del Gaslini abbiamo collaborato 0:25 //
brevemente il meccanismo di come questi potenziatori //
parliamo prima dei potenziatori // come questi potenziatori si pensa possano agire 0:39 //
il questo di nuovo è schematizzata la proteina CFTR con i suoi segmenti
transmembrana i due nucleotide binding domain il dominio R che è il
sito di fosforilazione 0:51 //
si pensa che quando la proteina CFTR è fosforilata fosforilata perché
c'è un aumento di AMP ciclico questo evento favorisce poi l'interazione
di due molecole di ATP che a loro volta producono una formazione si
pensa del dimero 1:11 // e questo evento determina l'apertura del canale e il trasporto di cloruro 1:17 //
nei mut- in alcuni particolari mutanti compreso anche delta F
cinquecento otto G cinquecento cinquantuno di e altri tutti che
appartengono alla classe terza c'è un qualche difetto di conformazione
della proteina che qui ho voluto rappresentare veramente in maniera
molto fantasiosa 1:35 //
ovviamente non c'è nessuna informazione vera sulla struttura finora o par- c'è qualcosa di parziale 1:41 //
io ho voluto rappresentare qui il difetto come un disallineamento tra i due nucleotide binding domain 1:47 //
si pensa che i potenziatori cioè queste molecole che aumentano
l'attività del canale vadano a interagire in una zona che sta
all'interfaccia tra i due nucleotide binding domain 1:56 //
questa è un'ipotesi un modello molto caro a Oscar Moran a Genova ma è
anche seguito anche da da altre persone David Shepard e altri 2:4 //
il potenziatore va a interagire in questo possibile sito di contatto
tra i due nucleotide binding domain riallineando o diciamo favorendo l-
la la l'assunzione da parte dei due NBD di una conformazione più nativa
che favorisce l'interazione con gli ATP con l'ATP e quindi eccoci qui
la la apertura del canale e il trasporto di cloruro 2:29 //
ora però è possibile domanda è possibile progettare un farmaco in maniera razionale 2:37 //
no 2:38 //
gli strumenti c- ora disponibili non permettono di dire ah ecco ora
posso disegnare a tavolino una molecola che possa fare questo lavoro 2:47 //
perché le informazioni sulla struttura della proteina disponibili
finora che stanno crescendo man mano non sono comunque così imponenti
da da f- permettere questo tipo di di di di lavoro 3:1 //
e allora per trovare nuove molecole si è seguito si segue quello che
fanno tutte le compagnie farmaceutiche per tutti i loro bersagli 3:9
// che è quello di procedere con indagini su vasta scala esaminando un
nu- un numero grandissimo di molecole di composti chimici alla ricerca
di composti attivi 3:21 //
quindi all'inizio il processo è la ricerca di migliaia centinaia di
migliaia o milioni di molecole che poi vengono vagliate via via // si
restringe sempre di più il campo dopo che si trovano i primi le prime
molecole attive e si fa la valutazione e si trova quelle che sono più
efficaci 3:38 //
c'era il problema per la CFTR come si poteva fare questo tipo di di lavoro 3:44 //
e la cosa interessante è stata la scoperta messa a punto di metodi che
sono in grado di misurare l'attività della proteina CFTR in cellule in
maniera molto veloce e automatizzabile 3:54 //
che è quello che è stato fatto nel progetto appunto che ha coinvolto
anche il nostro laboratorio in collaborazione con l'Università della
California 4:2
// poi è stato fatto anche dalla compagnia farmaceutica Vertex con due
approcci apparentemente diversi ma che in realtà sono simili 4:9 //
in un caso si è usata una proteina fluorescente che è stata modificata
opportunamente in maniera da renderla sensibile a variazioni
intracellulari di cloruro 4:21 //
e nell'altro caso la la compagnia Vertex ha usato una sonda anch'essa
fluorescente per misurare potenziali di membrana che comunque sono
riconducibili alle attività della proteina CFTR 4:31 //
qui c'è un filmato molto breve che misu- vi fa vedere la quanto semplice sia questo saggio 4:39 //
in pratica si misurano variazioni di concentr- di immissione luminosa 4:44 // scusate dovrebbe partire così 4:49 //
se voi guardate in pochi secondi c'è una perdita di luminosità delle
cellule che riflette proprio l'attività della proteina CFTR 4:58 //
questo tipo di saggio molto veloce può essere utilizzato per scrinare un grandissimo numero di molecole 5:3
// se le cellule vengono seminate in pozzettini di micro piastre il si
può mis- e mettendo un composto in ogni piastra e in ogni piastra
misurando l'emissione luminosa si può determinare l'eventuale presenza
di un composto attivo 5:18 //
perché i composti inattivi daranno un cambiamento di luminosità molto lento 5:23 // i composti che determinano un'attività daranno una una variazione di luminosità veloce 5:29 //
e questo tipo di di di saggio appunto è così semplice al punto tale che può essere automatizzato come mostrato in questo film 5:39 //
questo è una cosa che avviene comunemente nelle compagnie farmaceutiche //
cioè l'utilizzo di apparecchiature robotizzate per fare screening su vasta scala 5:47 // e questo è l'approccio che è stato utilizzato anche per trovare molecole attive sulla proteina CFTR mutata 5:53 //
quindi questo era semplicemente per darvi un'idea del tipo di di approccio 5:58
// cioè un un un sistema che permette con alta riproducibilità di
effettuare saggi che altrimenti richiederebbe molto tempo nel caso di
diciamo soggetti umani 6:8 //
con questo approccio sono state trovate molte nuove molecole che sono in grado di funzionare sulla proteina CFT- CFTR mutata 6:18 //
qui stiamo parlando di potenziatori che agiscono sul delta F cinquecento otto //
nel duemilatre ci sono stati i primi risultati 6:24 //
altre molecole sono state trovate nel in un successivo screening 6:29 //
le prime che vi ho fatto vedere su centomila composti 6:32 //
queste su cinquantamila // altri cinquantamila composti hanno portato all'identificazione di fenilglicine e sulfonamidi 6:38 //
qualche dato sperimentale //
non vi voglio tediare ma semplicemente per coris- per in per un concetto importante che riguarda i potenziatori 6:49 //
queste molecole sono in grado di ripristinare in maniera molto imponente l'attività della CFTR mutata 6:56 //
questo è un tracciato che misura vi fa vedere l'andamento temporale dell'attività della CFTR in seguito a vari trattamenti 7:5 //
questa forskolina non è altro che una sostanza che aumenta le AMP
ciclico intracellulare // cioè è una è un la maniera con la quale noi
stimoliamo le cellule e mimiamo lo stimolo fisiologico // cioè
aumentiamo la l'AMP ciclico e quindi cerchiamo di stimolare la proteina
CFTR 7:21
// questa linea tratteggiata vorrebbe indicare schematicamente quale
sarebbe stato il comportamento di una proteina CFTR normale 7:29 //
in questo caso invece in cui stiamo esaminando la proteina delta F cinquecento otto vediamo che la risposta è solo parziale 7:36 //
tuttavia se noi aggiungiamo in questo caso un un composto che era la
fenilglicina una delle fenilglicine aggiungiamo in concentrazioni
crescenti vediamo un aumento dell'attività che raggiunge valori
pressoché normali 7:50 //
questo è stato visto anche negli esperimenti di patch clamp effettuati nel nostro laboratorio 7:57 //
il patch clamp è una tecnica che misura direttamente l'attività di canali ionici del canale CFTR 8:3 //
la traccia superiore qui è semplicemente una un'oss- un esempio di come si comporta il canale mutato 8:9 //
riusciamo a misurare da un pezzettino di membrana l'attività del del
canale e questi due livelli sono chiuso aperto chiuso aperto chiuso 8:18 //
quindi il tempo in cui il canale rimane chiuso è piuttosto lungo //
questo perché proprio la mutazione determina una compromissione
dell'attività 8:27 //
se noi a questo stesso pezzettino di membrana come mostrato qui sotto
aggiungiamo un potenziatore vediamo che in realtà c'è un un aumento di
attività molto imponente 8:37 //
i canali qui in realtà erano più di uno come si dimostra dai vari livelli 8:41 //
in realtà questo canale questo pezzettino di membrana non aveva un solo
canale ma ne aveva ben quattro cioè quattro molecole di CFTR e si vede
che tutti e quattro si aprono e certe volte anche tutti e quattro
contemporaneamente 8:54 //
in altre parole se noi computiamo questi tipi di esperimenti e
calcoliamo quello che si chiama in termine tecnico la prob- probabilità
di apertura del canale l'attività del canale passa da un valore molto
basso a un valore alto che è comparabile paragonabile a quello della
proteina CFTR normale 9:12 //
tutta questa tiritera in realtà è per sottolineare una cosa che i
potenziatori molti di questi potenziatori sono veramente molto efficaci
in grado di ripristinare la funzione della della proteina a valori
pressoché normali 9:26 //
non solo delta F cinquecento otto ma anche altri mutanti come G
cinquecento D G cinquecento cinquantuno B G milletrecentoquarantanove D
// e in realtà noi abbiamo dei dati che dimostrano che anche altre
mutazioni missenso con difetto di attività addirittura localizzate in
regioni diverse della proteina sono risponsive ai potenziatori 9:45 //
non sappiamo con quale meccanismo 9:47 // che è quello che è detto qui 9:49 //
nel nostro laboratorio abbiamo effettuato al Gaslini anche un altro
tipo di di approccio che è stato quello di effettuare screening non di
di molecole di dalle proprietà ignote ma anche di direttamente di
farmaci già approvati dalle varie agenzie del farmaco come la FDA
americana o per la EMEA europea 10:13 //
questo è stato un un progetto che è stato per primo finanziato dalla
Fondazione italiana fibrosi cistica qui da Verona e questo ha poi
spinto la nostra ricerca e ora è un progetto che viene supportato anche
dalla Cystic Fibrosis Foundation americana 10:29 //
qual è il principio di questo //
ovviamente è un è u- è un è un approccio estremamente rischioso 10:35
// perché mentre il la ricerca di centinaia di migliaia di molecole
assicura una qualche probabilità di riuscita qui stiamo parlando di un
un numero di molecole che è intorno al migliaio 10:47 //
quindi la probabilità di trovare qualcosa di utile // ricordiamo queste sono molecole in uso per altre malattie //
noi stiamo cercando stiamo facendo un azzardo //
vogliamo vedere se per caso qualcuna di queste abbia un effetto anche sulla proteina CFTR 11:0 //
quindi una cosa molto rischiosa però potete capire molto potrebbe dare
un ritorno molto importante se si trovasse una molecola efficace già di
per sé nella sua formulazione 11:11 //
ma noi riteniamo anche se non si ritrovasse una molecola un farmaco già
in uso efficace sulla proteina CFTR nella sua formulazione proprio come
si trova in in farmacia // comunque sarebbe e lo è come abbiamo visto
un risultato molto importante perché le molecole già in uso hanno
portano con sé tutta una serie di informazioni che riguarda le
proprietà farmacologiche in vivo gli effetti collaterali effetti su
target secondari e si conosce soprattutto il meccanismo di azione sul
loro bersaglio primario e sul bersaglio secondario 11:45 //
e questo ha portato come forse saprete all'identificazione del di uno
quattro diidropiridine farmaci che vengono utilizzati per la per il
trattamento dell'ipertensione come molecole in grado di attivare la
proteina CFTR mutata 11:59 //
il composto tra quelli avevamo i farmaci tra i quali avevamo provato
tra le tutte le quattro diidropiridine che avevamo potuto provare la
felodipina era la più efficace 12:11 //
tuttavia è qui appunto il problema la felodipina non è utilizzabile di
per sé probabilmente come potenziatore in quanto la agisce sulla
proteina CFTR a concentrazioni che sono ben superiori alle
concentrazioni che vengono normalmente utilizzate per il trattamento
dell'ipertensione 12:30 //
e quindi noi abbiamo affrontato un progetto successivo i cui risultati
sono stati pubblicati proprio sono in corso di pubblicazione proprio in
questi giorni 12:39 //
uno studio in cui abbiamo appunto continuato la collaborazione con il
professor Mazzei del dipartimento di chimica farmaceutica
dell'Università di Genova alla ricerca del quali fossero i criteri
strutturali che venivano richiesti per attivare la proteina CFTR 12:56 //
qui non sto a discutere questo questo questi grafici 13:0 //
però il il la metodica è stata analizzare trecentotrentatré analoghi
della felodipina alla ricerca di possibili di modificazioni della
struttura di base che potessero assicurare un miglioramento della
selettività verso la proteina CFTR 13:14 //
e in effetti abbiamo trovato che alcune modificazioni permettono alla molecola di perdere attività sui canali del calcio //
come vedete da questo spostamento di affinità // e al tempo stesso le
stesse modificazioni permettono di aumentare l'attività sul CFTR 13:29 //
quindi esiste dimostriamo in questo modo la il principio di base che è
possibile modificare le diidropiridine in maniera da avere molecole che
sono più selettive per CF- per CFTR 13:42 //
quindi concludiamo una prima parte della presentazione dicendo qual è la situazione dei potenziatori 13:48 //
tutto diciamo il mio soffermarmi sulla parte sperimentale voleva
appunto dire che ci sono ora tutto un ventaglio di molecole che sono
attive scoperte nel appunto da vari laboratori che sono in grado di
attivare in maniera molto efficace la proteina CFTR 14:6 //
sono attive sul mutante delta F cinquecento otto e su altri mutanti e
possibilmente sono buoni candidati per lo sviluppo di farmaci 14:15 //
anzi come ho messo qui la compagnia farmaceutica Vertex ha uno di questi potenziatori ormai già in studi clinici di fase uno //
quindi queste molecole sono promettenti 14:26 // possono essere portate a livello di sperimentazione clinica 14:29 //
qua- qual è la situazione per i correttori 14:32 //
quindi ho parlato molto di potenziatori per poi per poter fare il
confronto con i correttori dove la situazione un po' meno felice 14:39 //
qui ci sono stati di nuovo molti diciamo entità presenti laboratori che
hanno partecipato a questa identifica- e stanno partecipando
all'identificazione di correttori 14:52 //
ricordiamo correttori sono quelle molecole che devono portare la proteina delta F cinquecento otto nella membrana plasmatica 14:59 //
di nuovo a questo lavoro hanno partecipato il professor Bergman e il
nostro laboratorio la compagnia Vertex Frederic Beck a Poitiers che ha
descritto per primo l'MPB zero sette non solo come potenziatore ma
anche come possibile correttore e successivamente ha identificato il
composto Miglustat che è interessante in quanto questo è un farmaco già
in uso per il trattamento di alcune malattie e su questo sta lavorando
anche il dottor Giulio Cabrini 15:26 //
e infine avrete sentito parlare della curcumina 15:29 //
curcumina è uscito lavoro su Science se non sbaglio 15:34 //
aveva suscitato molto clamore perché la curcumina è semplicemente è una spezia usata nella preparazione degli alimenti //
e può essere assunta in concentrazioni mostruose //
quindi non è del n- per niente tossica 15:44 //
e aveva dimostrato efficacia sui topi con con i topi che esprimono delta F cinquecento otto 15:53 //
quindi aveva su- suscitato molto interesse tuttavia purtroppo molti
laboratori hanno trovato non sono riusciti a riprodurre questi
risultati 16:1 //
quindi io l'ho messa qui perché era un risultato molto che aveva
suscitato molto clamore ma pot- direi che si potrebbe an- mettere anche
un crocione forse sulla sulla curcumina 16:10 // poi ev- eventualmente nella discussione possiamo parlarne 16:13 //
correttori 16:14 // qual è il meccanismo invece per i correttori 16:17 //
allora di nuovo qui ho voluto rappresentare schematicamente una una
porzione di una cellula del reticolo endoplasmatico e in cima la
membrana plasmatica 16:26 //
nel caso della delta F cinquecento otto la proteina CFTR in realtà non
riesce a superare tutta una serie di controlli di qualità che dicono
alla cellula questa è una proteina anomala 16:37 // non deve arrivare alla membrana 16:38 // deve essere degradata nel proteozoma 16:40 // solo poc- pochi livelli bassi livelli di proteina arrivano in membrana 16:45 //
come se non bastasse la proteina viene riconosciuta come anomala anche
nella membrana plasmatica e viene velocemente internalizzata 16:53 //
infatti più laboratori hanno dimostrato che la proteina delta F
cinquecento otto in membrana ha un'emivita che è almeno quattro volte
inferiore all'emivita di una proteina normale 17:2 // quindi il difetto in realtà è a più livelli 17:5 // il correttore cosa dovrebbe fare 17:8 //
l'ideale sarebbe trovare una molecola che è in grado di interagire
direttamente con la proteina CFTR promuovendo un qualche cambiamento
nella conformazione // per cui questa proteina diventa non più anomala
ma diventa più stabile 17:22
// viene riconosciuta come normale dai sistemi di controllo di qualità
cellulari e viene portata ad alti livelli nella membrana 17:30 //
quindi un correttore che possiamo chiamare anche pharma- pharmacological chaperon //
qualcosa che interagisce direttamente con la proteina 17:38
// tuttavia come vi dicevo prima dobbiamo tenere in considerazione che
in realtà il difetto delta F cinquecento otto è tale il difetto di
maturazione anche perché la proteina delta F cinquecento otto
interagisce con tutta una serie di proteine cellulari che appunto la
riconoscono come anomala 17:53 //
quindi un correttore potrebbe in realtà essere efficace anche se agisce
indirettamente perché potrebbe andare a interagire con i sistemi di
controllo di qualità del reticolo endoplasmatico o potrebbe anche
andare a agire perifericamente cercando di stabilizzare quel po' di
proteina che arriva nella membrana plasmatica stabilizzarla e tenerla
per più tempo appunto nella membrana plasmatica 18:18 //
ovviamente un una molecola che agisce direttamente sulla proteina CFTR
sarebbe più desiderabile perché in teoria sarebbe potrebbe dare meno
effetti collaterali 18:30
// mentre un correttore che agisca in direttamente sui proteine del
controllo qualità potrebbe avere dei problemi perché potrebbe avere un
effetto anche su sulle proteine cellulari normali sul co- normale
controllo della della sintesi proteica 18:45 //
anche qui per l'identificazione di correttori si è seguito l'approccio che vi ho fa- vi ho fatto vedere prima //
cioè l'indagine su vasta scala di tantissimi composti chimici alla
ricerca di molecole che fossero in grado di salvare di recuperare la
proteina mutata dal reticolo endoplasmatico ma anche di di aumentare la
la stabilizzazione della proteina mutata nella membrana 19:9 //
e qui in realtà sono state trovate anche qui delle molecole attive però
il ventaglio di molecole attive purtroppo è inferiore rispetto a quello
dei potenziatori 19:18 //
nel caso del nostro lavoro con Alan Bergman // il lavoro che è stato
pubblicato nel duemilacinque // in realtà tra quattro famiglie una sola
e in particolare un solo composto è risultato attivo 19:31 //
è risultato attivo anche nelle cellule bronchiali di soggetti con delta F cinquecento otto in condizioni di omozigosi 19:40
// come potete vedere qui questo è il comportamento di un epitelio in
condizioni non di non trattamento // c'è la risposta alla foscolina è
pressoché è molto basso pressoché nulla 19:52 //
se noi trattiamo le cellule con uno di questi correttori vediamo un
aumento della risposta che è paragonabile a quello che si ottiene
incubando le cellule con basse temperature 20:2 //
però se noi andiamo a fare la statistica questo è il comportamento del
di una di una cellula normale di un epitelio di soggetti normali 20:13 //
qui stiamo misurando la secrezione di cloruro dipendente da CFTR 20:17 //
se vedete la scala e se vedete un delta F cinquecento otto qui e la
correzione che si ottiene con i correttori in realtà sono efficaci //
sono ef- l- l'effetto è statisticamente </stastisticamente/>
significativo però l'effetto è relativamente piccolo e raggiunge il il
appena il dieci per cento della funzione normale 20:39 //
quindi questi questo per sottolineare che i correttori sono stati
identificati però c'è ancora del lavoro da fare per quanto riguarda la
l'identificazione di miglioramento di tali composti o l'identificazione
di composti migliori 20:52 //
la la correzione della delta F cinquecento otto per quanto riguarda la
ma- il difetto di maturazione non è dimostrato solo a livello
funzionale ma anche a livello biochimico 21:2 //
queste sono si va a vedere la mobilità elettroforetica della della proteina 21:7 //
e si può dimostrare che questo è lu- normale scusate questo è il
comportamento della proteina normale con una banda della proteina
matura molto intensa // questo è il comportamento della proteina delta
F cinquecento otto // si vede solo la banda immatura e non si vede la
banda matura 21:26 //
se noi incubiamo le cellule delta F cinquecento otto con qualcuno di
questi correttori vediamo un aumento della banda matura ma potete
vedere che rispetto alla forma matura del s- diciamo di una proteina
normale l'effetto è è piccolino 21:41 // quindi sicuramente deve es- questo deve essere migliorato 21:45 //
i correttori sono stati trovati anche dalla compagnia farmaceutica Vertex 21:49 // qui di nuovo si dimostra il miglioramento della maturazione 21:53 //
i i dati che sono stati pubblicati nel nel duemilasei 21:59 //
nel nostro laboratorio in questo momento stiamo facendo un confronto
tra i vari correttori per vedere lar- l'efficacia relativa tra di loro 22:9 //
abbiamo confrontato il correttore quattro A che è quello che noi
abbiamo trovato con Bergman con i correttori a disposizione della
Vertex della compagnia Vertex 22:17
// e non solo nelle cellule su cui abbiamo fatto in tutti questi anni
gli esperimenti ma anche su un altro tipo di cellule // sono A cinque
quattro nove // proprio per vedere se ci fossero delle differenze 22:28 //
e quello che vediamo se possiamo sintetizzare i risultati è che gli
effetti sono sempre relativamente piccoli anche con i correttori della
Vertex 22:38 // raggiungono superano di poco oppure non raggiungono addirittura l'effetto della bassa temperatura 22:44 //
e l- diciamo il le varie c'è una certa differenza di comportamento tra
una cellula e un'altra che potrebbe far suggerire che il bersaglio di
questi correttori non è la proteina CFTR stessa ma come è molto
probabile a- altre proteine coinvolte nella maturazione della proteina
CFTR 23:2 //
la cosa interessante e questi sono i dati preliminari è che in real- se
noi mettiamo insieme correttori di diverso tipo // in questo caso
correttore quattro A con correttore Vertex // otteniamo un effetto
additivo 23:16 //
e questo è un'ulteriore indicazione che effettivamente il bersaglio di queste queste molecole è è diverso 23:23 //
e quindi e questi sono studi che interessanti s- per cercare di capire il meccanismo di azione ma non solo 23:29 //
permettono di dire che in realtà c'è ancora spazio per correzione //
quello che noi vediamo non è il tetto massimo raggiungibile // in
realtà si può ottenere un effetto correttivo maggiore trovando o
combinazioni o meglio una singola molecola che possa veramente fare
questo tipo di effetto maggiore 23:47 //
quindi situazione correttori 23:49 //
ci sono alcune molecole attive // non così tante come i potenziatori 23:53 //
l'attività è parziale 23:54 //
l'attività correttiva è parziale ma nonostante tutto questo a un
recente meeting la un rappresentante della compagnia Vertex ha detto
che è possibile loro prevedono lo sviluppo di un correttore che potrà
andare in trial clinici per il duemilaotto 24:12 //
quindi non un farmaco intendiamoci ma un farmaco un farmaco per i
pazienti ma comunque un farmaco sperimentale che potrebbe essere
sperimentato sui pazienti al già a partire dal duemilaotto 24:24 //
ovviamente su questa molecola non sappiamo niente // non c'è niente di pubblicato // né struttura né 24:30 //
finiamo ora con con queste classi di mutazioni e andiamo invece sulle mutazioni di classe uno 24:38 //
le mutazione di classe uno sono costituite da mutazioni stop 24:42 //
cioè quando viene introdotto dalla mutazione stessa un codone di stop
prematuro per cui la proteina CFTR viene sintetizzata in maniera
parziale 24:54 // si produce cioè una una una una proteina tronca 24:58 //
fino a forse non molti anni fa si pensava che questo non fosse
assolutamente un bersaglio druggable cioè un qualcosa che potesse
essere corretto da farmaci // e in realtà questo è stato smentito
clamorosamente da studi effettuati prima in vitro e poi in vivo 25:16 //
si scoprì forse si sapeva già da studi sui batteri che gli
aminoglicosidi sono in grado di alterare il processo di sintesi
proteica 25:26 //
qui ho voluto rappresentare schematicamente questo processo //
voi sapete che la sintesi proteica avviene mediante lettura del RNA messaggero da parte del ribosoma che è rappresentato qui 25:36 //
il ribosoma quello che fa in corrispondenza di ogni codone aggiunge un amminoacido 25:41 //
e continua così a procedere facendo una catenella di aminoacidi che
saranno poi la la la la la la andranno a costituire la la proteina 25:50 // quando arriva un codone di stop si ferma 25:54 //
se il codone di stop è normale è quello normale di una proteina ecco
termina la sintesi proteica // una produzione di proteina normale 26:1 //
se invece questa mutazione se questo codone di stop è un codone in
realtà abnorme è presente in maniera prematura cioè al a metà del
diciamo all'interno della sequenza modificante ecco che la proteina non
viene più sintetizzata // il ribosoma si arresta e quindi si produce
nel caso della CFTR una proteina tronca non funzionale 26:23 //
ecco quello che era stato dimostrato qualche anno fa in più di uno
studio è che se noi aggiungiamo un aminoglicoside la gentamicina
otteniamo che cosa // che probabilmente il ribosoma in qualche modo
viene convinto a non essere così rigoroso e a introdurre in
corrispondenza del codone di stop un amminoacido a caso 26:40
// quindi permettendo il superamento del codone di stop e favorendo la
sintesi proteica che prosegue fino all'arrivo del codone di stop
normale 26:50 //
tuttavia questi sono stati ecco dimenticavo questo è stato fatto anche in vivo //
era un lavoro pubblicato sul New England Journal of Medicine soprattutto da un gruppo israeliano 27:2 //
e israeliano è comprensibile che in Israele l- la frequenza di mutazioni non senso è molto alta 27:8 // credo che sia trenta e quaranta per cento anche 27:10 //
in questo studio si dimostrava che effettivamente il trattamento con
gentamicina applicato topicamente sulla mucosa nasale di questi
pazienti di- non solo determinava la sintesi di una proteina normale ma
anche ripristinava la funzione misurata con potenziali nasali 27:28 //
tuttavia la gentamicina credo non non sia proponibile per il
trattamento di tali pazienti perché la concentrazione alla quale era
efficace era molto alta e si conosce e si conoscono bene gli effetti
tossici di degli aminogli- aminoglicosidi ad alte concentrazioni 27:45 //
quindi una compagnia che è la PTC Therapuetics ha messo a punto un
composto che si chiama PTC centoventiquattro di cui di cui si conosceva
ben poco // non si sapeva assolutamente come loro avessero trovato
questo farmaco // in realtà ora si sa tutta la storia perché è uscito
pochi giorni fa il lavoro su Nature in cui hanno descritto tutto quanto
28:6 //
e di nuovo è un composto non aminoglicosidico // completamente diverso 28:10 //
tra l'altro la struttura non è neanche presente 28:13 //
comunque il man- la maniera con cui loro hanno trovato questo composto
è di nuovo attraverso lo screening su vasta scala // hanno tro- cercato
su ottocentomila composti un composto che riproducesse l'attività della
gentamicina 28:26 //
e alla fine hanno trovato questo PT cen- PTC centoventiquattro che è in
corso di studio su pazienti con fibrosi cistica e su pazienti con
distrofia muscolare di Duchenne 28:37
// e ed ovviamente poiché agisce sulla mutazione di stop non è sp- non
è specifico solo per questo ma in teoria utilizzabile su tutte le
malattie genetiche in cui c'è ci sono mutazioni di stop 28:50 //
in questo studio su Nature loro hanno dimostrato che e che questa era
la domanda più importante che questi questo composto qui è in grado di
correggere le mutazione di stop // quindi di superare l'ostacolo
costituito da codoni di stop anomali ma non di alterare il
funzionamento di codoni di stop normali 29:12 //
eventualmente possiamo parlarne dopo durante la discussione del di come questo possa avvenire 29:18 //
sì e questo è il lavoro su su Nature che è comparso pochi giorni fa e
in cui sono stati fatti tutti una serie di di di dimostrazioni che
riguardano non fibrosi cistica ma distrofia muscolare ma comunque sono
ovviamente risultati estrapolabili 29:34 //
e come vi ho detto prima ci sono credo che sia già concluso un trial
clinico di fase due anche per fibrosi cistica ma i risultati devono
essere ancora prodotti 29:43 //
quindi vi avevo prec- in qualche diapositiva in una diapositiva
precedente vi avevo detto che era molto interesse per queste due classi
di mutazioni perché erano bersagli aggredibili con farmaci //
in realtà da quello che vi ho detto ora dobbiamo espandere questo anche alla classe uno 29:60 //
quindi queste sono vedete che esistono tutta una serie di possibilità
per cercare di recuperare la funzione della proteina CFTR 30:9 //
ora molto brevemente il la modulazione farmacologica di altri canali ionici 30:15 // quindi qui andiamo direttamente a cercare di ripristinare la funzione della proteina CFTR 30:22 //
un altro possibile approccio è quello di invece di aggirare l'ostacolo
pr- costituito dalla proteina proteina CFTR e andare a stimolare altri
canali 30:32 //
e realtà si sa che sulla membrana apicale delle cellule epiteliali
esiste un altro canale del cloruro che è presente nei pazienti con
fibrosi cistica e sembra funzionare normalmente 30:45 //
quindi questo canale viene chiamato s- CA- CACC per clacium-activated
chloride channel // cioè è un canale del cloruro che invece di essere
attivato da AMP ciclico come CFTR è attivato da calcio 30:58 //
quindi la strategia che è stata esegui- seguita da da da alcuni in
particolare dalla compagnia farmaceutica Inspire è quella di generare e
di cercare di stimolare farmacologicamente
</farmacologica_camente/> questo canale 31:13 //
come 31:13 // questo canale può essere come vi dicevo attivato in seguito a un aumento intracellulare di calcio 31:18 //
quindi quello che si è fatto è e questo canale può essere attivato
fisiologicamente attraverso recettori che innescano l'aumento di calcio
come i recettori polinergici e in particolare un recettore che viene
chiamato P due Y due che è presente sulla stessa membrana 31:36 //
quindi la compagnia farmaceutica Inspire ha prodotto un analogo
dell'uridina trifosfato che è un messaggero fisiologico di questo
recettore 31:47
// ha prodotto un analogo che è praticamente un UTP un r- un uri-
uridina trifosfato più resistente al all'idrolisi e quindi più stabile
sulla alle diciamo ai vari enzimi che tenderebbero a degradarla 31:59 //
e questo molecola è effettivamente in grado di produrre un'attivazione di questo canale 32:5 //
sono stati fatti dei già delle sperimentazioni cliniche // e pochi
giorni fa è stato pubblicato su questa rivista i risultati di uno di
uno studio di fase due in cui il Denufosol è stato somministrato per
via aerosolica a un gruppo di pazienti per ventotto giorni ed è stato
riportato un effetto piccolo ma significativo se si tiene conto della
della diciamo della durata del del trial 32:30 // un un aumento significativo della funzionalità respiratoria rispetto a ai soggetti di controllo 32:36 //
il tutto cioè esistono tutta una serie di molecole a vari sono stati
trovati verso vari bersagli che agiscono con vari mecas- meccanismi 32:48 //
tutte queste molecole devono andare incontro al processo di sviluppo di
un farmaco che è quello classico e viene seguito in tutti in tutti i
paesi che è quella appunto di partire dalla identificazione della
molecola 33:1 //
cercare di ottimizzare questa molecola modificando la struttura in
maniera da tro- generare molecole sempre più potenti e selettive 33:10 //
c'è la s- la valutazione preclinica 33:14
// quindi preclinico vuol dire sperimentazioni su animali tossicologia
metabolismo assorbimento formulazione eccetera // e poi le
sperimentazioni cliniche che sono di fase uno fase due e fase tre 33:26 //
e come riportato qui sotto il qui sopra vedete il numero di anni medio
per ottenere una dalla fase iniziale di scoperta alla fase di di di
arrivo nel ai pazienti c'è un numero di anni diciamo di una ce- di un
certo significato 33:48 //
e qui in fondo vedete quelli che mediamente si ritengono siano i costi
che sono molto elevati che non riguardano soltanto la l'identificazione
delle delle molecole attive ma riguardano soprattutto proprio la
sperimentazione clinica che è molto costosa 34:2 //
prima di finire questa è una diapositiva che potete scaricare da
internet dal sito della Cystic Fibrosis Foundation che è la la una
delle entità che supporta in maniera particolare tutte le le le le
diciamo le ricerche che mirano all'identificazione di molecole attive 34:22 //
qui sono mostrati i vari approcci // terapia genica // modulazione
della CFTR // ripristino del trasporto ionico // regolazione del muco
// antinfiammatori // antiinfettivi eccetera 34:36 // e qui le varie fasi per quindi vi illustra qual è la situazione 34:40 //
come potete vedere parlando di farmacoterapia del difetto di base
alcune molecole come PTC centoventiquattro Denufosol sono piuttosto
avanti mentre altre che riguardano direttamente la proteina CFTR hanno
sono in una fase ancora più preliminare 35:1 //
quindi le conclusioni sono il difetto di base nella fibrosi cistica è
costituito da una ridotta di secrezione di cloruro a livello di vari
epiteli e questo tipo di difetto può essere corretto almeno per alcune
mutazioni con un approccio farmacologico 35:21
// come abbiamo visto questo potrebbe essere una una una strategia
alternativa a quella costituita dalla terapia genica cellulare 35:27 //
ma ricordiamo se il bersaglio è la CFTR di questi approcci
farmacologici questi farmaci devono essere mirati a classi di mutazioni
o a tipi di mutazioni //
non possono essere generali 35:39 //
la ricerca </ricesca/> di composti chimici ha tr- ha identificato potenziatori e correttori 35:46 //
i potenziatori sono più avanti i correttori sono più indietro
probabilmente perché il difetto di maturazione come ci si poteva
aspettare costituito dal delta F cinquecento otto è un bersaglio
farmacologico particolarmente difficile 35:59 //
tuttavia quello che è incoraggiante è che la soglia terapeutica
potrebbe essere veramente bassa // cioè il tipo di correzione
raggiungibile con farmaci anche se non massima potrebbe essere comunque
di un di un significato importante 36:16 //
anche le mutazioni non senso sono aggredibili farmacologicamente al
punto tale che addirittura potrebbe esserci disponibile si spera un
farmaco per queste mutazioni addirittura prima di altri 36:27 //
una cosa importante però è che è quello che è necessario identificare
parametri validi per determinare l'efficacia di nuovi farmaci in vitro
e in vivo 36:41 //
infine credo che sia piuttosto interessante e promettente la
l'approccio attraverso canali del cloruro alternativi ad esempio il
Denufosol di cui si sono già fatti trial di fase due e f- e credo ci
siano anche iniziano già trial di fase tre 36:58 //
questo può essere un un approccio che se non risolutivo potrebbe
comunque migliorare la condizione a livello polmonare favorendo la
secrezione di cloruro il trasporto mucociliare il battito ciliare //
insomma potrebbe essere un qualcosa che migliora la funzionalità
respiratoria o ne rallenta il il decorso 37:18 //
e credo di aver finito 37:21 //
e ringrazio diciamo le le le le istituzioni che hanno supportato il nostro lavoro 37:30 //
la Fondazione fibrosi cistica di Verona la Fondazione Telethon e la Cystic Fibrosis Foundation americana //
grazie 37:38
Interpretation (TL text)
(conference title: V Italian CF Spring Seminar, Recent Advances and Future Developments in CF Research conference reference: CFF5 conference main topic: health conference date: 2007-05-11 conference location: Verona conference session: presentation session title: Pharmacotherapy of the CF basic defect speech event: paper or lecture speech number: 049b speech type: int-it-en speech title: Farmacoterapia del difetto di base nella fibrosi cistica duration: long timing: 2259 speech length: long number of words: 4131 speed: medium words per minute: 110 speech delivery: mixed audio visual support: yes conference participant: interpreter
conference participant ID: IT-02 gender: f country: Italy language: en native speaker: no directionality: B materials provided to interpreters: in advance audio link: DIRSI-2007-05-11-VR-CFF5-049b-int-IT-en comments: NA)
over the last years there were two main bodies that looked actively for new compounds 0:12 //
one is the pharmaceutical company Vertex which is sponsored by the f-
f- Foundation American Foundation and a professor in San Francisco that
cooperates with our institute at the Gaslini hospital 0:29 //
so we talk now of enhancer and the mechanism that they use //
how they work 0:37 //
this again is a a picture of a CFTR protein and the binding domain the R domain which is the phosphorilation site 0:50 //
we believe that when the CFTR protein is phosphorilated because there's
an increase in cyclic </ciclic/> AMP in cAMP this favours the
interaction of two ATP molecules which become integrated and create
this mechanism which determines the opening of the channel and the
passage of chloride 1:18 //
in some abnormal and mutated proteins of the third class there is a defect in the formation of the protein 1:31 // and this is just an hypotheses //
there's no real information on this structure so far or there are just partial results 1:41 //
I wanted to sh- to describe the the defect as a non allineation of the two parts 1:50 //
so we think that enhancers are used to interact between the two parts of the binding domain 1:57 //
and this is a model that we use in Genoa or also elsewhere //
and the enhancers acts in this binding site of the domain reallineating
realigning the two different parts in the original form which favours
interaction with ATP and again opening the channel for Cl 2:26 //
now it is possible and this is a question is it possible to create a drug in a rational way 2:37 //
no 2:38 //
the available tools da- do not allow us to say okay we need that so we design a drug that can do that //
because information on the protein so far has is no not so developed now 2:57 // so we still have too little information to do this 3:1 //
so to c- to have new drugs to develop new drugs we decided to start a
large scale analysis analysing a huge library of chemical compounds in
order to find active compounds 3:22 //
so we started with millions of chemicals that then is restricted at a
certain point after we find active molecules and then we we take those
that are more efficient 3:38 //
with with these CF- with CFTR what can we do 3:44 //
well we can use methods that can measure the activity of CFTR in the cells in a very standardised and fast way 3:55 //
and our laboratory in cooperation with the University of California as
well as ve- Vertex pharmaceutical company carried out these very
studies 4:8 //
in one case we used a marked protein that was modified so that it was sensitive to intracell variation of chloride 4:19 //
and Vertex used a a probe a f- a fluorescent probe in order to find potential of membranes that can be connected to CFTR 4:32 //
and now I want to show you a short film to show you how easy this test is 4:43 //
we evaluate fluorescent dots 4:48 //
in a few seconds you see there's a reduction in the light of cells in
the luminosity of cells and this reflects the activity of CFTR 4:57 //
and this test can be used very quickly to check very many cells if you use a microarray in micro place 5:8
// in ea- in each micro place you isolate the illuminated the marks
fluorescent emission and you can finally find the active compound 5:21 //
because of course i- in non active compounds will have very little
change in light while active compounds will have a dramatic change 5:31 //
and this test is so easy that can be also performed by a robot 5:38 //
and this is something that is commonly done in pharmaceutical companies 5:43 //
they use robots for large-scale screenings and this is the same approach that we use to find active compounds on abnormal CFTR 5:53 //
so this is just to give you an idea on the system that we used which is highly reproducible 6:2 // otherwise we would need a ver- a very long time to obtain the same results 6:8 //
with this approach we managed to find a lot of molecules that are active with regards to the mutant CFTR 6:17 //
we are talking about enhancers here that have an influence on delta F </FC/> five o eight 6:24 //
the first molecules were found in two thousand and three //
then we had some more molecules in the following two years 6:34 //
and we found phenilglicine and sulphonomides </sulphonamia_mides/> 6:38 //
now few figures 6:42 //
I don't want to bore you but I believe that this is an important concept regarding enhancers 6:48 //
these molecules can significantly re- modify the activity of CFTR protein and activate it again 7:6 //
this substance forskolin is a substance that can stimulate cells and we
in this way we increase AMPc and this dotted line here is a stimulation
of a normal CFTR protein 7:28 //
here we are analysing delta F five o eight protein and we see only a partial response 7:36 //
but if we had a compound in this case it was one of the phenilglisines
and then we add higher concentrations we see that we are able to
achieve nearly normal results 7:50 //
tiu- this was also obtained in other analyses called patched clamp 7:57 //
that is a technique that analyses the activity of Cl minus channel 8:2 //
and this is just an example of how the abnormal chan- channel performs 8:9 //
and we are able from a single part of the membrane to see how it works 8:16 // so closed open closed open 8:18 //
the time in which the Channel is closed is quite long because the mutation compromises the activity of the channel 8:27 //
here below if we had an enhancer we see that there is an increase a significant increase in the activity of the channel 8:37 //
there are different channels // you see there's more than one 8:41 // you see the different levels 8:43 //
there are four of them 8:45 // and also above you have four channels 8:47 // and you see here that all four of them are open sometimes at the same time 8:53 //
so in other words if we create a a a table graph from the same data we see the probability of opening of the channel 9:4 // we start from a very low level and we reach a very high level 9:8 // basically the same as a normal chief- CFTR protein 9:13 //
this is just to stress that enhancers many of them are really very
effective and they are able to take the values of CFTR activation to
the normal level 9:27 //
and this correction is also valid for other mutants // you see here other missense mutations 9:38 // and you see the different kinds of compounds that are efficient to increase activities 9:48 //
in our laboratory we carried out also another kind of activity 9:55
// we performed screenings not on unknown compounds but also on of
compounds and drugs that had already been approved by the FDA in
America and the European EMEA 10:18 //
this project was first financed and supported by the Foundation here in
Verona and then we started it again in Gaslini and we cooperated with
them // now it's also performed in America 10:31 //
what's the principle here 10:32 //
it's a very risky approach because research of several thousands of
molecules guarantees a certain level of success // and here the number
is quite low //
and these drugs are used are currently used for other diseases 10:55 //
and we are here just making a hypothesis //
maybe these drugs can be also effective for CF 11:3 //
so it's a risky approach but it could have very very important and positive impact if we found some results 11:11 //
but even if we didn't find a drug already in use which is efficient on
CFTR // a drug I mean in the formulation and with the composition you
find at the at in the pharmacy maybe we could have anyway a lot of
information in vivo information side-effects secondary effects // and
we also know the the mech- the mechanism // how they work etcetera 11:43 //
and as you might know this led to the id- identification of this compound which are molecules that can activate mutated CFTR 11:59 //
the drugs that we tested revealed that phelodipine is the most efficient 12:10 //
but phelodipine cannot be used per se probably as enhancer because it
acts on CFTR with concentrations that are a lot higher than the usual
concentrations that you find to treat anti- hypertension 12:32 //
here there's a series of other studies that are being published right now 12:39 //
and in this study in particular we continued to the cooperation with Professor Mazzei from Genoa 12:46 // and we looked at the structural criteria that we are requested required to activate CFTR protein //
but I I don't want to go into detail on these graphs 12:59 //
but our approach was to analyse three hundred and thirty-three
analogues of felodipine and searching for basic modifications that
maybe were more sensitive to the protein 13:14 //
and we actually found that some modifications allowed the molecule to
lose activity with regards to chloride channel but maybe activity was
increase on CFTR 13:29 //
so in this way we demonstrate the basic principle that it is possible
to modify compounds common compounds that are more efficient for CFTR 13:41 //
so I would like to conclude the first presentatio- the first part of my presentation summing up the situation of enhancers 13:49 //
I wan- I focused on the experimental part because I want to stress that
now there are a whole series of active m- molecules that were
discovered by different laboratories and can activate in very efficient
ways CFTR protein 14:8 //
and they are active on delta F five o eight but also on other mutations 14:14 //
and the Vertex Pharmaceutic com- company has one of these enhancers which is in stage one clinical trial 14:24 //
so this is a very promising field that can be actually used in the following years 14:30 //
which what is the situation for correctors //
because I want to talk also about this aspect 14:38 //
again there were a lot of institutes laboratories and private companies
that participated and are actually participating now in the
identification of correctors 14:54 //
what does a corrector do 14:58 // well they bring the mole- protein delta F five o eight and they they the- they increase the transport of the protein 15:9 //
here you see Frederik Birk wa- was the first to identify the compound
MPB zero seven miglustat and this is an important aspect because this
drug is currently used for other diseases 15:26 //
and then you probably have you you know already about curcuma 15:33 //
this is just a spices 15:37 //
you can use it in huge amounts //
it's not toxic at all 15:43 //
and it was efficient in mouse mice in CF mouse with delta F five o eight 15:54 //
so this was an interesting aspect but many la- unfortunately many laboratories weren't weren't able to reproduce the results 16:3 //
so basically I I've put it in the list but unfortunately we should really take it away from the list 16:14 //
what is the situation for correctors 16:18 //
here again you see the portion of a cell the endoplasmatic reticulum on top the plasma membr- plasma membrane 16:27 //
and you see that here what happens // that the defective protein ca-
doesn't succeed in passing all the controls because the quality system
of the body says no this is this doesn't work properly 16:47 //
and so and also in the plasma membrane the protein is recognised as defective and is taken inside the cell 16:56 //
this is the reason why the mutant cell the defective protein sorry has
a survival rate of fo- which is four time less than the normal protein 17:11 //
so what do we want to find now 17:13
// we want to find a corrector that interacts directly with the
defective protein to stabilise it and to be recognised as a normal
protein by the co- cell control systems so that it can reach the
membrane 17:31 //
this corrector can be also defined as a pharmacological chaperone 17:38 //
this must be but anyway we have to consider that delta F five o eight
protein the defect this protein interacts with a series of other cell
compounds which recognise it as defective 18:1 //
and so we have to select an adequate corrector because this corrector will interact with several aspects in the cell 18:11 // and the corrector's aim is to keep the protein on the membrane for as much time as possible 18:21 //
a molecule that acts directly on the protein of course is more is more
adequate because it can it can prevent some side effects on normal
control systems or other normal proteins and pro- normal pro- protein
synthesis 18:46 //
here again for the identification of correctors we followed the same approach as before 18:52 //
a large-scale analysis of many compounds in order to find molecules
that were able to rescue delta F five o eight protein from the
endoplasmic </endoplasmatic/> reticulum and that were also able
to stabilise protein on the membrane 19:10 //
here again we found active molecules but unfortunately the range of the molecules is less than for the enhancers 19:19 //
with Alan Bergman we published a work in two thousand and se- and five
and we found four families of compounds but only one fa- one of them
was active 19:34 //
also in patients with delta F five o eight as homo- homozygous we find these bronchial results 19:50 //
you see here again if we put a corrector we see an increase in the the results 19:60 //
but if we create a statistical table we see this is the behaviour of a normal cell 20:10 //
here we measure chloride secretion CFTR dependent 20:18 //
here you have a delta F five o eight and the correction that you can achieve with correctors 20:24 //
you see there's some effectiveness and statistical signifi- statistically significant results 20:31 // but well in fact what we have is maximum ten per cent of the normal function 20:41 //
so we have we do have a positive result result but there's still a lot to do to identify active and better compounds 20:51 //
correction of delta F five o eight as long as maturation is concerned
is not demonstrated only at a functional level but also at biochemical
level 21:3 //
here you see the protein and the ionophore- ionophoric </ionophorenic/> activity 21:10 //
this is the normal protein with very intense colour and this is the behaviour of the defective protein //
you see the immature part but not the mature part 21:25 //
if you use a corrector on the defective protein we see that there is an
increase in c- in colour but in comparison to the normal protein well
we still have a lot to do 21:43 //
correctors were also found by Vertex pharmaceutical company and again we see an increase in maturation 21:53 //
these data were published in two thousand and six 21:58 //
in our laboratory at the moment we are comparing different correctors to see relative effectiveness 22:7 //
we compared four A corrector with other available correctors from
Vertex not only in normal cells that we usually analyse but also in A
five four nine cells in order to see if there are differences 22:29 //
what we see we can just sum up the results is that we have relative
improvements in the results that exceed just slightly the effect of low
temperature or not even reach the effects of low temperature
</termer/> temperature 22:49 //
and there's a certain difference between the the cells 22:53 // so what we can arg- what we can suppose is that here these molecules do not only target CFTR protein 23:4 //
these are da- some data that show that if we put together correctors of
different kinds for example a four A with a VRT corrector we obtain a
relative increase 23:20 //
so we see that the effects of these molecules are different //
the w- the mechanism and the way of actions are different 23:29 //
and we can also infer from the results that there's still field for increase //
we can still have increases by finding combinations or rather a single molecule that can produce better results 23:46 //
so what's the situation about correctors 23:49 //
there are some active molecules 23:51 //
activity is partial 23:53 //
correction activity is partial 23:56
// but at a recent meeting a representative of Vertex said that it is
possible and that they they want to develop a corrector that could
reach the clinical trial phase by two thousand and eight 24:13 //
so not a drug but an experimental drug that could be tested on patients starting from two thousand and eight 24:23 //
we don't know anything obviously about this molecule structure or nothing 24:29 //
so I would like to finish with this class of mutations and now I would like to talk a little bit about class one mutations 24:39 //
we call them stop mutations 24:42 //
this happens when a stop codon is introduced too early by the mutation and so the the protein is only partially synthesised 24:57 //
until a few years ago we didn't think that this was something that could be corrected by drugs but in fact this is not true 25:8 //
some studies in vitro first and then in vivo allowed us to discover but
maybe we knew that already but aminoglycosides can alter protein
synthesis process 25:25 //
here I just want to show the the process //
you know that protein synthesis happens through encoding of the ribosome which is represented here 25:37 //
what happens 25:38 // in correspondence to each codon it adds an amino acid 25:42 // it creates an amino acid chain which will then constitute the protein 25:48 //
when it reaches a stop codon it stops 25:55 //
if it's a normal stop codon </colo_don/> the synthesis ends and a n- a common a normal protein is produced 26:3 //
but if this is a defective stop codon an early stop codon which is in-
included maybe in the middle of the seq- including sequence then the
protein is no longer </lorgen/> synthesised and the encoding
stops and a nonfunctional protein is created 26:23 //
few years ago it was demonstrated that if we add an aminoglycoside for
example gentamicine we are able to convince the ribosome not to be so
strict about stopping the encoding and it introduces a a random amino
acid and then it continues with the encoding 26:49 //
sorry I was forgetting this was also done in vivo 26:55 //
it was carried out in a study that was published on the Journal of Medicine by a group in Israel 27:2 //
and it is understandable because in Israel I think that the frequency
</frequel_quency/> of nonsense mutation is very high forty thirty
per cent something like that 27:13 //
in this study it was demonstrated that the gentamicine applied on the
nasal mucus of the patients not only determine the creation of a normal
protein but it also increased the function 27:28 //
but I think that gentamicine cannot be proposed for the treatment of
these patients because concentrations at which it was efficient was
very high and we know that aminoglycosides at high concentrations have
very bad side-effects 27:49 //
a new compound has been created PTC one two four 27:54 //
we didn't know why and how they created this drug until a few days ago
because the article published in Nature was was published a few ye-
days ago 28:11 //
and this is a completely new far- drug non aminoglicosidic and they found it using again a large-scale study 28:21 //
they found </founded/> a compound that reproduced the activity of
ge- of gentamicine and they found that this PTC one two four which is
now part of an ongoing study with CF and DMD patients 28:39 //
it acts on stop mutations so it's not really specific for these
diseases but also for all other genetic diseases with problems at the
stop codon 28:55 //
what did they demonstrate // they demonstrated that this compound is
able to overcome bypass the obstacle of the abnormal stop codon but
they don't alter </alterate/> the normal regular stop codons 29:13 //
maybe we can discuss later how this happens 29:19 //
and this is the work that appeared in Nature a few days ago 29:23
// they carried out a series of demonstrations not on CF but on
muscular dystrophy but of course the results can also be applied to CF 29:35 //
and I think that the a a phase two clinical trial has just been completed but the results are not yet available 29:45 //
this slide again shows you that the most interesting classes are class two and class three because they are druggable targets 29:56 //
but we need to expand now after the last prese- part of the presentation to class one 30:4 //
so there are a series of activities approaches available to increase and recover CFTR activity 30:15 //
and now what we want to do is again to recover the function of CFTR protein 30:22 //
but another possible approach is to bypass the obstacle and stimulate other channels 30:30 //
we know that on the membrane of epithelial cells there's another Cl
channel which is present in CF patients and seems to function properly 30:46 //
it's called CACC calcium activated chloride sha- sha- channel which is not activated by CFTR but by calcium 30:57 //
so what was the strategy that we applied and by others in particular by the Inspire pharmaceutical company 31:8
// well well they wanted to pharmacologically stimulate this channel by
activating it augmenting calcium in in the in the cell 31:19 //
what they and this channel can be also activated physiologically through receptors that increase the amount of calcium 31:30 //
in particular this one which is called P two Y two on the same membrane 31:36 //
so Inspire produced a UTP analog which is practically a UTP which is more resistant to hydrolysis 31:53 //
so it's more stable to degrading enzymes 31:58 //
and this molecule is able to produce and to activate this channel 32:4 //
some clinical experiments have already been carried out and few days
ago the results were published on this review and this journal and it's
a phase two study 32:17 // the Denufosol was administered to CF patients and we see here the results 32:28 // we see that even for such a short period twenty eight days we have a significant increase in lung function 32:39 //
then there is a whole series of molecules that work with several different mechanisms 32:47 //
and all these molecules must be used to develop a regular drug 32:54 // and the stage is to start from the identification of the molecule 32:59 //
then we try to optimise the molecule by altering the structure in order to have more and more powerful and selective molecules 33:10 //
then there's the preclinical evaluation and toxicology meta- metabolism
experiments on animals absorption formulation and then clinical trials
phase one two three 33:24 //
here on top you have the average duration elapsing from the begi- the
discovery to the drug which is finally available for patients 33:44 // it's a long time 33:46 //
and here at the b- at the bottom you have the costs which are very high
because it's not just a matter of identifying active molecules but
they're they depend in particular from the experiments on the
experiments 34:4 //
this is a slide that you can download from the Cystic Fibrosis Foundation's web site 34:11 //
and
here you see all the kinds of research and the approaches gen- gene
therapy CFTR modulation ion transport recovery and all kinds of
different approaches and the situation for each field of research and
development of drugs 34:43 //
some molecules for example PTC one two four and nufoso- Denufosol are
quite at an advanced stage while for example other drugs re- we- in
particular those targeting CFTR are at a very early stage of analysis 35:4 //
so my conclusions are that the basic defect in CF is const- is based on
a reduced secretion of Cl minus in different membranes and these defect
can be corrected in particular for particular mutations with a
pharmacological </pharmalogical/> approach as an alternative to
gene and cell therapy 35:28 //
but we must to bear in mind that these drugs must be targeted to class of mutation and kind of mutation //
they cannot just be general drugs 35:39 //
res- large-scale research identified enhancers and correctors 35:46 //
potentia- enhancers are at a more advanced stage of development while correctors need further studies 35:59 //
what is encouraging is that the therapeutic threshold is very low so
the kind of correction reachable with drugs could be also less then the
recovery of the normal function and nonsense mutations can also be
druggable targets 36:20 //
we hope that a drug is already available or is going to be available soon for this mutation 36:30 //
what what is important is also that it is essential to identify valid
parameters to determine the efficiency of new drugs in vivo and in
vitro 36:40 //
finally I think that it's also promising the approach to find new chloride channels alternative chloride channels 36:54 // for example the using Denufosol 36:56 // and this is already a molecule a compound that is in the phase three clinical study 37:3 //
and maybe this will not treat completely the disease but will help with
mucociliary clearance and other aspects that can effectively increase
lung function and slow down decline in lung function 37:19 //
I think thats the end of my presentation //
I would like to thank the institutions that supported our work 37:28 //
the fou- the Cystic Fibrosis Foundation in Verona la Cystic Fibrosis Foundation in the US and all the others 37:37 //